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近日，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心王凱研究組在《自然-方法》（Nature Methods）上，在線發(fā)表了題為Volumetric Voltage Imaging of Neuronal Populations in Mouse Brain by Confocal Light Field Microscope的研究論文。該研究開發(fā)了新型三維光場顯微成像技術(shù)，提升了神經(jīng)元電壓光學(xué)成像的通量。這一技術(shù)能夠?qū)π∈竽X三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中數(shù)百神經(jīng)元的膜電位進(jìn)行高速同步記錄，為解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的信息處理機(jī)制提供了新工具。

光場成像需要高靈敏度、大靶面的相機(jī)來同時記錄多個視角的投影圖像。而由于相機(jī)的數(shù)據(jù)帶寬受限，大靶面相機(jī)的幀率無法滿足電壓成像的速度需求。

該團(tuán)隊(duì)提出通過降低采集圖像的動態(tài)范圍來換取更高的幀率。通常情況下電壓成像需要較高的動態(tài)范圍來捕捉高基線上微弱變化的信號，但該團(tuán)隊(duì)采用廣義共聚焦原理，高選擇性濾除背景來降低信號基線，并整合多個視角的信息，實(shí)現(xiàn)了利用低動態(tài)范圍的相機(jī)來高效捕捉微弱的電壓信號。

進(jìn)一步，為了最大限度降低系統(tǒng)的噪聲，該團(tuán)隊(duì)探討了光場成像中的噪聲來源，發(fā)現(xiàn)了激光光源的強(qiáng)度噪聲、掃描振鏡的同步噪聲以及動物血液流動導(dǎo)致的激光散斑噪聲均能夠降低電壓成像的信噪比。同時，該研究提出了基于單振鏡雙面掃描的共聚焦光場成像技術(shù)。這一技術(shù)結(jié)合高數(shù)值孔徑的光照明策略和新數(shù)據(jù)處理方法，將系統(tǒng)噪聲降低至泊松噪聲理論極限。

為了最大化熒光信號的捕獲效率，實(shí)現(xiàn)長時程持續(xù)電壓成像，該研究優(yōu)化了系統(tǒng)的光學(xué)效率。研究顯示，通過自主設(shè)計(jì)定制密集排列的微透鏡陣列并最小化光學(xué)元件的數(shù)量，系統(tǒng)的通光效率比前期工作提高約3倍。

該團(tuán)隊(duì)將這些成果整合在新型共聚焦光場顯微鏡中，實(shí)現(xiàn)了對清醒小鼠腦三維視場中數(shù)百個神經(jīng)元的電壓信號的同步記錄，并以每秒400幀的速度連續(xù)成像超過20分鐘。新型共聚焦光場顯微鏡彌補(bǔ)了電壓成像在成像通量、信噪比與成像時長上的不足，提升了電壓成像的應(yīng)用范圍。為了驗(yàn)證電壓成像獲取的信號真實(shí)可靠，該團(tuán)隊(duì)記錄了清醒小鼠初級視皮層中數(shù)百個神經(jīng)元對光柵視覺刺激的反應(yīng)特性。通過對神經(jīng)元動作電位發(fā)放情況的統(tǒng)計(jì)，電壓成像鑒別出具有不同方向選擇性的神經(jīng)元，而這些具有調(diào)諧特征的神經(jīng)元占比與該區(qū)域已知的神經(jīng)元特性相符。

進(jìn)而，該團(tuán)隊(duì)對數(shù)百個神經(jīng)元構(gòu)成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了功能連接分析。研究發(fā)現(xiàn)，與膜片鉗記錄相比，電壓成像可在清醒動物中開展，且通量提高約100倍。分析表明，神經(jīng)元之間同時存在興奮性和抑制性功能連接，在短距離內(nèi)抑制性連接強(qiáng)于興奮性連接。這種興奮-抑制的連接差異在三維空間上近似垂直于皮層表面的圓柱體。

該團(tuán)隊(duì)研發(fā)了新型三維電壓成像新技術(shù)，提高了電壓成像的通量，使在清醒動物中進(jìn)行三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能聯(lián)接分析成為可能。這一技術(shù)為電壓成像技術(shù)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為神經(jīng)科學(xué)研究提供了新工具。

研究工作得到科學(xué)技術(shù)部、國家自然科學(xué)基金委員會、中國科學(xué)院及中國博士后科學(xué)基金的支持。

三維光場電壓成像顯微鏡示意圖和小鼠腦三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電壓成像示例圖