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加快打造原始創(chuàng)新策源地，加快突破關(guān)鍵核心技術(shù)，努力搶占科技制高點(diǎn)，為把我國(guó)建設(shè)成為世界科技強(qiáng)國(guó)作出新的更大的貢獻(xiàn)。

——習(xí)近平總書記在致中國(guó)科學(xué)院建院70周年賀信中作出的“兩加快一努力”重要指示要求

面向世界科技前沿、面向經(jīng)濟(jì)主戰(zhàn)場(chǎng)、面向國(guó)家重大需求、面向人民生命健康，率先實(shí)現(xiàn)科學(xué)技術(shù)跨越發(fā)展，率先建成國(guó)家創(chuàng)新人才高地，率先建成國(guó)家高水平科技智庫，率先建設(shè)國(guó)際一流科研機(jī)構(gòu)。

——中國(guó)科學(xué)院辦院方針

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微生物所等破解過氧化氫酶參與天然產(chǎn)物生物合成機(jī)制

2019-10-24 微生物研究所

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語音播報(bào)

　　煙曲霉（Aspergillus fumigatus）可以產(chǎn)生麥角生物堿fumigaclavine C（圖2A），并且其生物合成基因簇已經(jīng)被報(bào)道。麥角生物堿化合物以色氨酸為起始，在途徑合成的第一步酶(異戊烯基轉(zhuǎn)移酶DmaW)和第二步酶（甲基轉(zhuǎn)移酶EasF）催化下合成1。酵母和構(gòu)巢曲霉中異源表達(dá)前四個(gè)基因（dmaW、easF、easE和easC），可以得到化合物2。但是體外從1到2是如何轉(zhuǎn)化的卻未見報(bào)道。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所高書山課題組就這一懸而未決的科學(xué)問題展開了研究。

　　生物信息學(xué)分析EasE是一個(gè)FAD依賴的氧化酶，研究者推測(cè)其為下一步的催化酶，于是在構(gòu)巢曲霉中共表達(dá)dmaW，easF和easE三個(gè)基因，產(chǎn)生了一個(gè)新化合物4（圖2B）。將4喂養(yǎng)煙曲霉ΔdmaW菌株，則修復(fù)了3的產(chǎn)生，證明4是途徑中的中間體。同源蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，EasC與過氧化氫酶（catalase）中的小亞基家族（SSC）高度同源，但是又具有多個(gè)不同的保守氨基酸位點(diǎn)。聚類分析發(fā)現(xiàn)，EasC蛋白處于一個(gè)獨(dú)立的分支。這些結(jié)果都表明EasC可能不僅僅具有過氧化氫酶活性。此外蛋白同源建模發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有與SSC類似的heme和NADPH結(jié)合位點(diǎn)。因此研究者推測(cè)EasC在化合物2的合成中具有重要功能。于是，研究者將easC，dmaW，easF和easE基因共同表達(dá)于構(gòu)巢曲霉中，HPLC分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了新化合物，NMR結(jié)構(gòu)鑒定該化合物的確是化合物2。接著，研究者在大腸桿菌中純化得到了可溶性的EasC蛋白，EasC可以在體外分解過氧化氫，驗(yàn)證了其過氧化酶活性。研究報(bào)道的過氧化氫酶和過氧化物酶均利用過氧化氫作為氧化劑，催化氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。但是研究者利用各種生化反應(yīng)手段，包括反應(yīng)體系添加或不添加過氧化氫、無氧催化、有氧催化、同位素標(biāo)記（¹⁸O₂和H2¹⁸O）等，在體外發(fā)現(xiàn)EasC蛋白是利用氧氣作為氧化劑，而不是過氧化氫，區(qū)域和對(duì)映體選擇性催化兩個(gè)非活化的sp³ 碳形成C-C鍵，并推測(cè)了EasC的催化機(jī)制，完整地解析了臨床重要藥物前體四環(huán)麥角生物堿的中心碳環(huán)形成機(jī)制。

　　本篇文章報(bào)道的過氧化氫酶EasC代表了一種全新類型的生物催化劑，它是自然界首個(gè)同時(shí)具有過氧化氫酶和單加氧酶活性的蛋白（圖2B）。本項(xiàng)目解決了該類藥物研究中半個(gè)多世紀(jì)以來懸而未決的難題，將為該類藥物的工業(yè)菌株優(yōu)化、代謝工程改造等研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。該研究成果已在《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》（Journal of the American Chemical Society）雜志在線發(fā)表，題為A Catalase Involved in Oxidative Cyclization of the Tetracyclic Ergoline of Fungal Ergot Alkaloids。微生物所助理研究員姚永鵬和博士后安春艷為論文共同第一作者，微生物所研究員高書山和加州大學(xué)洛杉磯分校教授K. N. Houk為共同通訊作者。該工作受到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院先導(dǎo)專項(xiàng)、自然科學(xué)基金委面上和青年項(xiàng)目以及中科院青年促進(jìn)會(huì)會(huì)員項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接

圖1：（A）麥角生物堿類藥物；（B）中心碳環(huán)形成

圖2：EasC是一種全新類型的雙功能酶

　　麥角生物堿類化合物最早于上世紀(jì)從真菌中分離得到，并廣泛產(chǎn)生于多種曲霉和青霉，被譽(yù)為最重要的臨床藥用分子和天然毒素（圖1A），在歐美市場(chǎng)上被廣泛用來治療癌癥、偏頭疼、產(chǎn)后大出血和帕金森癥，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的上市藥物有12種。研究表明，麥角生物堿結(jié)構(gòu)中的Ergoline四元環(huán)是該類化合物的藥效團(tuán)，它與神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)構(gòu)比較類似，可以特異性結(jié)合人腦中的各種神經(jīng)遞質(zhì)受體。自20世紀(jì)50年代以來，藥效團(tuán)Ergoline環(huán)中的C環(huán)生物合成機(jī)制一直是各國(guó)科學(xué)家的研究重點(diǎn)，在該領(lǐng)域發(fā)表了大量論文，前輩科學(xué)家的研究證明了EasC和EasE兩個(gè)蛋白參與了C環(huán)的生物合成（圖1B），但是具體的分子生物學(xué)與酶學(xué)機(jī)制仍然沒有解析清楚。
　　煙曲霉（Aspergillus fumigatus）可以產(chǎn)生麥角生物堿fumigaclavine C（圖2A），并且其生物合成基因簇已經(jīng)被報(bào)道。麥角生物堿化合物以色氨酸為起始，在途徑合成的第一步酶(異戊烯基轉(zhuǎn)移酶DmaW)和第二步酶（甲基轉(zhuǎn)移酶EasF）催化下合成1。酵母和構(gòu)巢曲霉中異源表達(dá)前四個(gè)基因（dmaW、easF、easE和easC），可以得到化合物2。但是體外從1到2是如何轉(zhuǎn)化的卻未見報(bào)道。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所高書山課題組就這一懸而未決的科學(xué)問題展開了研究。
　　生物信息學(xué)分析EasE是一個(gè)FAD依賴的氧化酶，研究者推測(cè)其為下一步的催化酶，于是在構(gòu)巢曲霉中共表達(dá)dmaW，easF和easE三個(gè)基因，產(chǎn)生了一個(gè)新化合物4（圖2B）。將4喂養(yǎng)煙曲霉ΔdmaW菌株，則修復(fù)了3的產(chǎn)生，證明4是途徑中的中間體。同源蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，EasC與過氧化氫酶（catalase）中的小亞基家族（SSC）高度同源，但是又具有多個(gè)不同的保守氨基酸位點(diǎn)。聚類分析發(fā)現(xiàn)，EasC蛋白處于一個(gè)獨(dú)立的分支。這些結(jié)果都表明EasC可能不僅僅具有過氧化氫酶活性。此外蛋白同源建模發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有與SSC類似的heme和NADPH結(jié)合位點(diǎn)。因此研究者推測(cè)EasC在化合物2的合成中具有重要功能。于是，研究者將easC，dmaW，easF和easE基因共同表達(dá)于構(gòu)巢曲霉中，HPLC分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了新化合物，NMR結(jié)構(gòu)鑒定該化合物的確是化合物2。接著，研究者在大腸桿菌中純化得到了可溶性的EasC蛋白，EasC可以在體外分解過氧化氫，驗(yàn)證了其過氧化酶活性。研究報(bào)道的過氧化氫酶和過氧化物酶均利用過氧化氫作為氧化劑，催化氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。但是研究者利用各種生化反應(yīng)手段，包括反應(yīng)體系添加或不添加過氧化氫、無氧催化、有氧催化、同位素標(biāo)記（18O2和H218O）等，在體外發(fā)現(xiàn)EasC蛋白是利用氧氣作為氧化劑，而不是過氧化氫，區(qū)域和對(duì)映體選擇性催化兩個(gè)非活化的sp3 碳形成C-C鍵，并推測(cè)了EasC的催化機(jī)制，完整地解析了臨床重要藥物前體四環(huán)麥角生物堿的中心碳環(huán)形成機(jī)制。
　　本篇文章報(bào)道的過氧化氫酶EasC代表了一種全新類型的生物催化劑，它是自然界首個(gè)同時(shí)具有過氧化氫酶和單加氧酶活性的蛋白（圖2B）。本項(xiàng)目解決了該類藥物研究中半個(gè)多世紀(jì)以來懸而未決的難題，將為該類藥物的工業(yè)菌株優(yōu)化、代謝工程改造等研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。該研究成果已在《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》（Journal of the American Chemical Society）雜志在線發(fā)表，題為A Catalase Involved in Oxidative Cyclization of the Tetracyclic Ergoline of Fungal Ergot Alkaloids。微生物所助理研究員姚永鵬和博士后安春艷為論文共同第一作者，微生物所研究員高書山和加州大學(xué)洛杉磯分校教授K. N. Houk為共同通訊作者。該工作受到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院先導(dǎo)專項(xiàng)、自然科學(xué)基金委面上和青年項(xiàng)目以及中科院青年促進(jìn)會(huì)會(huì)員項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)支持。
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　　圖1：（A）麥角生物堿類藥物；（B）中心碳環(huán)形成
　　圖2：EasC是一種全新類型的雙功能酶
　　

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